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KOBRA - Dokumentenserver der Universität Kassel  → Fachbereiche  → FB 10 / Mathematik und Naturwissenschaften  → Institut für Biologie  → Fachgebiet Biochemie  → Publikationen 

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http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:hebis:34-2009111931122

Titel: Molekulare Mechanismen der cAMP-vermittelten Signaltransduktion
Autor(en): Moll, Daniela [früherer Name]Bertinetti, Daniela
Klassifikation (DDC): 570 - Biowissenschaften, Biologie (Life sciences)
Erscheinungsdatum: Mai-2007
Herausgeber: Universität Kassel, Abteilung Biochemie
Zusammenfassung: Zusammenfassung - Der sekundäre Botenstoff zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) reguliert viele fundamentale zelluläre Prozesse wie Zellproliferation, Differenzierung, Energiemetabolismus und Genexpression. In eukaryotischen Zellen vermittelt die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) die meisten biologischen Funktionen von cAMP. Die PKA besteht aus jeweils zwei regulatorischen (R) und katalytischen (C) Untereinheiten, die zusammen einen inaktiven Holoenzymkomplex bilden, der durch cAMP aktiviert wird. In dieser Arbeit wurde die Bindung von cAMP und cAMP-Analoga an die R Untereinheit der PKA unter funktionellen und mechanistischen Aspekten untersucht. Eine neue, auf Fluoreszenzpolarisation basierende Methode wurde entwickelt, um die Affinität von cAMP-Analoga in einem homogenen Ansatz schnell, reproduzierbar und nicht radioaktiv zu quantifizieren. Zur detaillierten Untersuchung des Bindungsmechanismus von cAMP und cAMP Analoga (Agonisten und Antagonisten) wurden thermodynamische Studien im direkten Vergleich mittels isothermaler Titrationskalorimetrie und kinetischen Analysen (Oberflächenplasmonresonanz, SPR) durchgeführt, wodurch thermodynamische Signaturen für das Bindungsverhalten der Nukleotide an die R Untereinheit der PKA erhalten werden konnten. Durch Interaktionsstudien an mutagenisierten R Untereinheiten wurde der intramolekulare Aktivierungsmechanismus der PKA in Bezug auf cAMP-Bindung, Holoenzymkomplex-Formierung und -Aktivierung untersucht. Die dabei erhaltenen Ergebnisse wurden mit zwei Modellen der cAMP-induzierten Konformationsänderung verglichen, und ein Aktivierungsmechanismus postuliert, der auf konservierten hydrophoben Aminosäuren basiert. Für in vivo Untersuchungen wurden zusammen mit Kooperationspartnern membranpermeable, fluoreszierende cAMP Analoga entwickelt, die Einblicke in die Dynamik der cAMP-Verteilung in Zellen erlauben. Neu entwickelte, Festphasen gebundene cAMP-Analoga (Agonisten und Antagonisten) wurden in einem (sub)proteomischen Ansatz dazu genutzt, natürliche Komplexe der R Untereinheit und des PKA-Holoenzyms aus Zelllysaten zu isolieren und zu identifizieren. Diese Untersuchungen fließen letztlich in einem systembiologischen Ansatz zusammen, der neue Einblicke in die vielschichtigen cAMP gesteuerten Netzwerke und Regulationsprozesse erlaubt.Summary - The second messenger cyclic adenosine monophosphate (cAMP) regulates many fundamental cellular processes like cell proliferation, differentiation, energy metabolism and gene expression. In the eucaryotic cell the cAMP-dependent protein kinase (PKA) mediates most biological functions of cAMP. The PKA consists of each two regulatory (R) and catalytic (C) subunits that form together an inactive holoenzyme complex, which is activated by cAMP. In this work the binding of cAMP and cAMP analogs to the R-subunit of PKA were investigated under functional and mechanistic aspects. A novel method, based on fluorescence polarisation, was developed to quantify the affinity of cAMP analogs in a homogeneous assay format in a rapid, reproducible and non-radioactive way. For a detailed analysis of the binding mechanism of cAMP and analogs thereof (agonists and antagonists), comparative thermodynamic studies were carried out by means of isothermal titration calorimetry (ITC) and kinetic studies (surface plasmon resonance, SPR), which allowed to obtain thermodynamic signatures for the binding of the nucleotides to the PKA R-subunit. By studies on mutagenised R-subunits, the intramolecular activation mechanism of PKA was investigated with respect to cAMP binding, as well as formation and activation of the holoenzyme. Thereby obtained data were compared to two models for cAMP-induced conformational changes, and an activation mechanism postulated that is based on conserved hydrophobic amino acids. For in vivo investigations, membrane permeable fluorescent cAMP analogs were developed together with co operation partners that allow to gain insight into the dynamics of the cellular cAMP distribution. Newly developed cAMP analogs (agonists and antagonists) were immobilised on a solid phase and used in a (sup)proteomic approach to isolate and identify native complexes of both the R-subunit and the PKA holoenzyme from cell lysates. These investigations ultimately merge in a Systems Biology approach allowing novel insight into the complex networks and regulatory processes controlled by cAMP.
URI: urn:nbn:de:hebis:34-2009111931122
Bemerkungen: Die vorliegende Dissertation basiert zwar auf meiner eingereichten kumulativen Dissertation, allerdings ohne die Original Artikel, die bei dem jeweiligen Verlag/Journal (ggf. kostenpflichtig) eingesehen werden können. Die bis zum Zeitpunkt meiner Dissertation noch nicht akzeptierten Manuskripte Publikation V und VI sind jetzt bei BMC veröffentlicht und finden sich unter: -----> Publikation VI - Moll, D., Prinz, A., Brendel, C. M., Berrera, M., Guske, K., Zaccolo, M., Genieser, H. G. and Herberg, F. W., "Biochemical characterization and cellular imaging of a novel, membrane permeable fluorescent cAMP analog", BMC Biochem 9, 18 (2008). -----> Publikation V - Bertinetti, D., Schweinsberg, S., Hanke, S. E., Schwede, F., Bertinetti, O., Drewianka, S., Genieser, H. G. and Herberg, F. W., "Chemical tools selectively target components of the PKA system", BMC Chem Biol 9 (1), 3 (2009).
Sammlung(en):Publikationen

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