Funktionsanalysen der Domänen des Vacuolin B und die Rolle des filamentösen Actins am Vacuolin B-positiven Kompartiment im endocytotischen Transit in Dictyostelium discoideum

Abstract

Ähnlich wie in Säugerzellen ist das neutrale Postlysosom in Dictyostelium discoideum von einem Coat aus filamentösem Actin umgeben. In dieser Arbeit wurde der Frage nach der Funktion dieses Actin-Cytoskeletts am späten Endosom nachgegangen. Hierzu wurde zunächst eine Analyse der Domänen des Vacuolin B durchgeführt, das als bisher spätester bekannter Marker im Endocytoseweg in Dictyostelium discoideum das neutrale, postlysosomale Kompartiment dekoriert. In einer Yeast Two Hybrid-Analyse wurden die Bereiche des Vacuolin B identifiziert, die für eine Selbst-Interaktion des Proteins notwendig und ausreichend sind. Es handelt sich dabei um die coiled-coil-Domäne und einen daran anschließenden, 18 Aminosäuren langen, alpha-helicalen Abschnitt. Diesem helicalen Bereich scheint die Funktion einer modifizierenden, die coiled-coil-Ausbildung vermittelnden oder initiierenden Faltungseinheit zuzukommen. Sie weist jedoch nicht die typischen Merkmale einer trigger-Helix auf. Lokalisationsuntersuchungen mit GFP-Deletionskonstrukten zeigten, dass es einen Zusammenhang zwischen Interaktionsfähigkeit und Bindung des Vacuolin an die Oberfläche später Endosomen gibt: Eine korrekte Lokalisation und Membranassoziation waren nur dann zu beobachten, wenn in der Yeast Two Hybrid-Analyse eine Interaktion nachgewiesen werden konnte. Es wurden die für die Lokalisation und Assoziation mit der vacuolären Membran notwendigen Sequenzbereiche identifiziert; diese waren jedoch nicht hinreichend. Vermutlich sind hierfür auch Sequenzen des N-Terminus notwendig. Die erhobenen Daten legen weiterhin eine Bedeutung der hydrophoben Domäne des Vacuolin B für die korrekte Faltung des Proteins nahe. Im Anschluss an die Domänenanalyse wurde Vacuolin dazu benutzt, durch Herstellung von Hybridproteinen Actin-interagierende Proteine gezielt an das späte Endosom zu transportieren. Es wurde deren Einfluss auf den lokalen Actin Coat und den endocytotischen Transit untersucht. Zwei Actin-bindende Proteine mit depolymerisierender Wirkung konnten im Rahmen dieser Arbeit getestet werden, nämlich Severin und Cofilin. Die Schwächung des lokalen Actin Coats durch das Vorhandensein von Severin an der späten Vacuole war nicht eindeutig festzustellen. Severin am Postlysosom führte nicht zu einer Veränderung der Transitkinetik von Flüssigphasenmarker. Allerdings konnte ein Defekt in der Phagocytose festgestellt werden. Es könnte hierbei ein Zusammenhang zwischen der Mobilisierung von intrazellulärem Calcium während der Partikelaufnahme und der Calcium-abhängigen Regulation der Severin-Aktivität bestehen. Das Hybridprotein aus Vacuolin und Cofilin zeigte neben einer Assoziation mit der vacuolären Membran auch eine Lokalisation im Cytoplasma und Cortex der Zellen. Mit der Lokalisation im Cytoplasma und Cortex korrelierte eine Veränderung der endocytotischen Aktivität. Das Vacuolin-Cofilin-Fusionsprotein am Postlysosom rief einen Verlust des lokalen Actin Coats hervor. Dies führte zu einer traubenförmigen Assoziation der späten Endosomen; exocytotische Parameter blieben jedoch unbeeinflusst. Aufgrund der hier erhobenen Daten kann vermutet werden, dass der Actin Coat am Postlysosom dazu dient, eine Agglutination dieser Endosomen zu inhibieren. Dies könnte ein Schutzmechanismus zum Ausschluss von Docking- und Fusionsereignissen sein.

In Dictyostelium discoideum the neutral post-lysosomal vacuoles are surrounded by a coat of filamentous actin, as they are in mammalian cells. In this study we tried to investigate the function of this actin coat. For this purpose, we first conducted an analysis of the domains of vacuolin B, which is currently the latest known marker in the endocytic pathway in Dictyostelium discoideum . It defines the neutral post-lysosomal compartment. In a yeast two-hybrid analysis the parts of vacuolin B necessary and sufficient for self-interaction of the protein could be identified. These are the coiled coil domain and an adjoining 18 amino acids comprising alpha-helical stretch. This alpha-helical stretch appears to function as a modifying folding unit, that might control or initiate the coiled-coil formation. However, it does not show the characteristics of a typical trigger helix. Investigating the localisation of various GFP-coupled vacuolin B deletion constructs led to the observation of a connection between the ability to interact and the localisation of vacuolin on the surface of the endosome: A correct localisation and membrane association of a given deletion construct could only be observed when there was also an interaction detectable in the yeast two-hybrid analysis. We identified the sequence areas which were necessary for localisation and association with the vacuolar membrane, but they were not sufficient. Therefore it has to be assumed, that N-terminal sequences are important, too. The data suggests that the hydrophobic domain plays a role in the proper folding of the protein. Based on the functional analysis of its domains we used vacuolin to construct hybrid proteins which would specifically target actin interacting proteins to the late endosomes. The impact of these actin interacting proteins on the local actin coat was monitored as well as kinetic parameters of the endocytic transit. Two actin interacting proteins with depolymerising activity could be tested in the framework of this study, namely severin and cofilin. A loss or weakening of the local actin coat in the presence of severin on the late vacuole could not be clearly detected. No change in the kinetics of fluid phase marker could be seen, but we observed a reduced rate of phagocytosis. An explanation for this defect might be found in the mobilisation of intracellular calcium during the process of internalisation of particles and the calcium-dependent regulation of severin activity. The hybrid-protein of vacuolin and cofilin (VMC) showed a clear localisation on vacuolar membranes. In clones expressing this protein at higher levels it could also be found in the cytoplasm and on cortical structures. Excessive VMC seemed to have a mild influence on early stages of the endocytic pathway. Counterstaining VMC-expressing cells to visualize filamentous actin revealed that vacuoles carrying the fusion-protein were devoid of a cytoskeletal coat. Accordingly, vacuoles lacking an actin coat aggregate to form huge clusters within the cell. This aggregation did not influence exocytotic parameters. Based on the data raised in this work it can be assumed that an actin coat can prevent the clustering of endosomes, which could be a safeguard mechanism precluding their docking and fusion.