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KOBRA - Dokumentenserver der Universität Kassel  → Fachbereiche  → FB 10 / Mathematik und Naturwissenschaften  → Institut für Biologie  → Fachgebiet Zoologie  → Dissertationen 

Please use this identifier to cite or link to this item: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:hebis:34-1792

Title: Studies of cap-independent mRNA translation in Drosophila melanogaster
Authors: Vazquez, Paula
???metadata.dc.subject.swd???: TaufliegeTranslationskontrolle
???metadata.dc.subject.ddc???: 570 - Biowissenschaften, Biologie (Life sciences)
Issue Date: 2-Feb-2005
Abstract: Control of protein synthesis is a key step in the regulation of gene expression during apoptosis and the heat shock response. Under such conditions, cap-dependent translation is impaired and Internal Ribosome Entry Site (IRES)-dependent translation plays a major role in mammalian cells. Although the role of IRES-dependent translation during apoptosis has been mainly studied in mammals, its role in the translation of Drosophila apoptotic genes has not been yet studied. The observation that the Drosophila mutant embryos for the cap-binding protein, the eukaryotic initiation factor eIF4E, exhibits increased apoptosis in correlation with up-regulated proapoptotic gene reaper (rpr) transcription constitutes the first evidence for the existence of a cap-independent mechanism for the translation of Drosophila proapoptotic genes. The mechanism of translation of rpr and other proapoptotic genes was investigated in this work. We found that the 5 UTR of rpr mRNA drives translation in an IRES-dependent manner. It promotes the translation of reporter RNAs in vitro either in the absence of cap, in the presence of cap competitors, or in extracts derived from heat shocked and eIF4E mutant embryos and in vivo in cells transfected with reporters bearing a non functional cap structure, indicating that cap recognition is not required in rpr mRNA for translation. We also show that rpr mRNA 5 UTR exhibits a high degree of similarity with that of Drosophila heat shock protein 70 mRNA (hsp70), an antagonist of apoptosis, and that both are able to conduct IRES-mediated translation. The proapoptotic genes head involution defective (hid) and grim, but not sickle, also display IRES activity. Studies of mRNA association to polysomes in embryos indicate that both rpr, hsp70, hid and grim endogenous mRNAs are recruited to polysomes in embryos in which apoptosis or thermal stress was induced. We conclude that hsp70 and, on the other hand, rpr, hid and grim which are antagonizing factors during apoptosis, use a similar mechanism for protein synthesis. The outcome for the cell would thus depend on which protein is translated under a given stress condition. Factors involved in the differential translation driven by these IRES could play an important role. For this purpose, we undertook the identification of the ribonucleoprotein (RNP) complexes assembled onto the 5 UTR of rpr mRNA. We established a tobramycin-affinity-selection protocol that allows the purification of specific RNP that can be further analyzed by mass spectrometry. Several RNA binding proteins were identified as part of the rpr 5 UTR RNP complex, some of which have been related to IRES activity. The involvement of one of them, the La antigen, in the translation of rpr mRNA, was established by RNA-crosslinking experiments using recombinant protein and rpr 5 UTR and by the analysis of the translation efficiency of reporter mRNAs in Drosophila cells after knock down of the endogenous La by RNAi experiments. Several uncharacterized proteins were also identified, suggesting that they might play a role during translation, during the assembly of the translational machinery or in the priming of the mRNA before ribosome recognition. Our data provide evidence for the involvement of La antigen in the translation of rpr mRNA and set a protocol for purification of tagged-RNA-protein complexes from cytoplasmic extracts. To further understand the mechanisms of translation initiation in Drosophila, we analyzed the role of eIF4B on cap-dependent and cap-independent translation. We showed that eIF4B is mostly involved in cap-, but not IRES-dependent translation as it happens in mammals.Die Kontrolle der Proteinsynthese ist ein entscheidender Schritt bei der Regulation der Genexpression während der Apoptose und bei der Hitzeschockantwort (engl. heat shock response). Unter diesen Bedingungen ist die Cap-abhängige Translation beeinträchtigt und die interne Ribosomen Eintrittsstellen-abhängige (engl. Internal Ribosome Entry Site, IRES) Translation spielt eine wichtige Rolle. Während die Funktion der IRES-abhängigen Translation während der Apoptose in Säugern untersucht wurde, bleibt ihre Funktion bei der Translation von Apoptosegenen in Drosophila weitestgehend unerforscht. Die Beobachtung, dass die Drosophila-Mutante für das Cap-bindende Protein, den eukaryotischen Initiationsfaktor 4E (engl. eukaryotic Initiation Factor 4E, eIF 4E), während der Embryogenese verstärkt apoptotisch wirksam ist und in Korelation mit der hochregulierten Transkription des proapoptotischen Genes reaper (rpr) verläuft, ist der erste Hinweis für die Existenz eines Cap-unabhängigen Mechanismus bei der Translation proapoptotischer Gene in Drosophila. Daher war die Untersuchung des Translationsmechanismus von rpr und anderen proapoptotischen Genen Gegenstand dieser Arbeit. Wir konnten feststellen, dass die 5 UTR der rpr mRNA die Translation auf eine IRES-abhängige Art und Weise steuert. Es treibt die Translation der Reporter-RNAs in vitro entweder in Abwesenheit des Caps, in der Anwesenheit von Cap-Kompetitoren, oder in Extrakten, welche von hitzeschockbehandelten und eIF4E mutierten Embryonen stammen und in vivo in Zellen, welche mit einem Reporter transfiziert wurden, welcher eine nichtfunktionelle Cap-Struktur enthält, voran. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die Erkennung des Caps in der rpr mRNA für die Translation nicht benötigt wird. Wir konnten zudem feststellen, dass die 5 UTR der rpr mRNA einen hohen Grad an Sequenzübereinstimmung mit dem Hitzeschockprotein 70 (engl. heat shock protein 70, hsp70), einem Antagonisten der Apoptose, aufweist, und dass beide Faktoren die Fähigkeit besitzen IRES-vermittelte Translation durchzuführen. Die proapoptotischen Gene head involution defective (hid) und grim, jedoch nicht sickle, zeigen auch IRES-Aktivität. Untersuchungen zur mRNA-Assoziation an Polysomen in Embryonen zeigten, dass die endogenen mRNAs von rpr, hsp70, hid und grim, in denen Apoptose oder thermaler Stress induziert wurde, an die Polysomen rekrutiert wurden. Wir kommen zu dem Schluß, dass zum einen hsp70 und außerdem rpr, hid und grim, welche antagonisierende Faktoren während der Apoptose sind, von einem ähnlichen Mechanismus bei der Proteinsynthese Gebrauch machen. Die Folge für die Zelle hängt einerseits davon ab, welches Protein unter den gegebenen Streßbedingungen translatiert wird, wobei Faktoren, welche an der durch IRES-gesteuerten differentiellen Translation beteiligt sind, dabei eine wichtige Rolle spielen könnten. Aus diesem Grund beschlossen wir die Ribonukleoproteinkomplexe (RNP-Komplexe) zu identifizieren, welche auf der 5 UTR der rpr mRNA assembliert sind. Wir etablierten ein Protokoll zur Tobramycinaffinitätsselektion, das die Aufreinigung spezifischer RNPs ermöglicht, welche dann weiter mittels Massenspektrometrie analysiert werden können. Verschiedene RNA-bindende Proteine, von denen einige in Beziehung mit der IRES-Aktivität stehen, konnten als ein Teil des rpr 5 UTR RNP-Komplexes identifiziert werden. Die Beteiligung eines Proteins, des La Antigens, an der Translation der rpr mRNA, konnte mittels RNA-Quervernetzung unter Verwendung rekombinanter Proteine und der rpr 5 UTR und außerdem durch die Analyse der Translationseffizienz von Reporter mRNAs in Drosophila Zellen nach dem Knockdown des endogenen La Proteins mittels RNAi (engl. RNA interference), bestätigt werden. Es konnten zudem auch mehrere uncharakterisierte Proteine identifiziert werden, die möglicherweise eine Rolle während der Translation, während der Assemblierung der Translationsmachinerie oder bei der Markierung der mRNA vor der Erkennung durch das Ribosom spielen könnten. Unsere Daten geben einen Hinweis darauf, dass das La Antigen an der Translation der rpr mRNA unmittelbar beteiligt ist und stellen ein Protokoll für die Aufreinigung von RNA-Proteinkomplexen aus Zellextrakten bereit. Um ferner den Mechanismus der Translationsinitiation in Drosophila zu verstehen, analysierten wir den Einfluss des eIF4B (engl. eukaryotic Initiation Factor 4B) auf Cap-abhängige und Cap-unabhängige Translation. Wir konnten zeigen, dass eIF4B größtenteils an der Cap-, jedoch nicht der IRES-abhängigen Translation beteiligt ist.
URI: urn:nbn:de:hebis:34-1792
???metadata.dc.description.everything???: Diese Arbeit entstand am Max-Planck-Institut für Biophysikalische Chemie, Göttingen.
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