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KOBRA - Dokumentenserver der Universität Kassel  → Fachbereiche  → FB 10 / Mathematik und Naturwissenschaften  → Institut für Biologie  → Fachgebiet Zellbiologie  → Dissertationen 

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http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:hebis:34-2007071018891

Titel: Manipulation der Aktin-Hülle später Endosomen durch ektopisches Protein-Targeting und Etablierung einer in vivo-Hierarchie cytoplasmatischer Targeting-Signalstärken
Autor(en): Schmauch, Christian
Klassifikation (DDC): 570 - Biowissenschaften, Biologie (Life sciences)
Erscheinungsdatum: 10-Jul-2007
Zusammenfassung: Der Endocytoseweg in Dictyostelium verläuft über definierte endosomale Reifestadien. Dabei werden die reifenden Endosomen im letzten Stadium durch eine Schicht aus filamentösem Aktin umhüllt. Über die biologische Funktion dieser Aktin-Hülle ist derzeit wenig bekannt. Zum weiteren Erkenntnisgewinn sollten daher unterschiedliche Aktin-interagierende Proteine an die endosomale Aktin-Hülle dirigiert und die sich daraus ergebenden Folgen untersucht werden. Dabei wurde der in Drengk et al., 2003 beschriebene Ansatz aufgegriffen, in dem Proteine durch die Fusion an Vacuolin an die späte endosomale Membran transportiert wurden. Die endosomale Lokalisation von DAip1 bewirkte den vollständigen Verlust der endosomalen Aktin-Hülle, ohne dabei das restliche zelluläre Cytoskelett zu beeinträchtigen. Dabei wird die Depolymerisation vermutlich über die nachgewiesene Interaktion von DAip1 mit dem Aktin-depolymerisierenden Protein Cofilin bewirkt. Einhergehend damit trat eine Aggregation der betroffenen Kompartimente, eine Verzögerung des endocytotischen Transits, sowie eine verstärkte Retention lysosomaler Enzyme auf. Diese Ergebnisse ließen auf eine Funktion der endosomalen Aktin-Hülle als Fusionsinhibitor oder in der Regulation von Recycling-Prozessen an späten Endosomen schließen. Die Verlängerung der endosomalen Verweilzeit des den Arp2/3-Komplex negativ regulierenden Proteins Coronin bewirkte dagegen keine offensichtlichen Veränderungen in den betroffenen Zellen. Diese Beoachtung könnte ein Indiz dafür sein, dass nach der Ausbildung der Aktin-Hülle keine weiteren essentiellen Arp2/3-abhängigen mehr an der endosomalen Membran auftreten. Die endosomale Lokalisation des Aktin-Crosslinkers ABP34 induzierte ebenfalls keine Abweichungen vom Wildtyp-Verhalten. Hierbei besteht allerdings die Möglichkeit, dass die Aktivität des Proteins durch die bereits zuvor beschriebene Calcium-Sensitivität beeintächtigt vorliegt. Eine Verstärkung der endosomalen Hülle konnte trotz der Verwendung unterschiedlicher Ansätze nicht hervorgerufen werden. Offensichtlich wirkt die zusätzliche Expression zentraler Regulatoren der Aktin-Polymerisation in der Zelle cytotoxisch. Die Bindung von VASP an die endosomale Membran bewirkte in den Zellen die Ausbildung voluminöser, cytoplasmatischer „Aktin-Bälle“. Diese riefen in den betroffenen Zellen Defekte in unterschiedlichen Aktin-abhängigen Prozessen, wie der Phago- und Pinocytose, sowie der Cytokinese hervor. Dabei gehen die beobachteten Veränderungen vermutlich auf die nachgewiesene Störung im Gleichgewicht zwischen G- und F-Aktin zurück. Obwohl die Aktin-Bälle an der endosomalen Membran entstehen, weisen sie nach vollendeter Entstehung keine inneren oder äußeren Membranen mehr auf und nehmen nicht mehr aktiv am endocytotischen Geschehen teil. Die nähere Charakterisierung offenbarte große Ähnlichkeit zu den mit unterschiedlichen neurodegenerativen Erkrankungen assoziierten Hirano-Bodies. Über das beobachtbare Lokalisationsverhalten der unterschiedlichen im ersten Teil der Arbeit eingesetzten Vacuolin-Hybridproteine ließ sich die Stärke der Lokalisationsinformationen der fusionierten Aktin-interagierenden Proteine miteinander vergleichen. Dies wurde verwendet, um die einzelnen Proteine gemäß ihres Targeting-Potenzials hierarchisch anzuordnen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden dieser Hierarchie die beiden cytoplasmatischen Targeting-Signale für Peroxisomen (PTS1) und den Zellkern (SV40-NLS) hinzugefügt. Der vorgenommene Vergleich dieser in vivo gewonnen Daten aus Dictyostelium mit unterschiedlichen in vitro-Bindungsstudien mit homologen Proteinen anderer Organismen zeigte eine erstaunlich gute Übereinstimmung. Diese Beobachtung lässt auf vergleichbare Targeting-Affinitäten innerhalb der Eukaryoten schließen und belegt, dass die zelluläre Lokalisation eines Proteins relativ sicher anhand der in ihm vorhandenen Bindungs-Affinitäten vorhergesagt werden kann. Durch die Kombination der in vivo- und in vitro-Daten war es auch ohne Kenntnis des Oligomerisierungsgrades und des Interaktionspartners erstmals möglich, die Bindungsstärke von Vacuolin an der endosomalen Membran auf einen definierten Bereich einzugrenzen.
URI: urn:nbn:de:hebis:34-2007071018891
Sammlung(en):Dissertationen

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