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KOBRA - Dokumentenserver der Universität Kassel  → Fachbereiche  → FB 10 / Mathematik und Naturwissenschaften  → Institut für Biologie  → Fachgebiet Entwicklungsgenetik  → Dissertationen 

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http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:hebis:34-2010060433111

Titel: Nuclear organisation and epigenetic regulation of gene expression in Dictyostelium discoideum
Autor(en): Dubin, Manu
Schlagworte (SWD): Dictyostelium discoideumGenexpression
Klassifikation (DDC): 570 - Biowissenschaften, Biologie (Life sciences)
Erscheinungsdatum: 4-Jun-2010
Zusammenfassung: A series of vectors for the over-expression of tagged proteins in Dictyostelium were designed, constructed and tested. These vectors allow the addition of an N- or C-terminal tag (GFP, RFP, 3xFLAG, 3xHA, 6xMYC and TAP) with an optimized polylinker sequence and no additional amino acid residues at the N or C terminus. Different selectable markers (Blasticidin and gentamicin) are available as well as an extra chromosomal version; these allow copy number and thus expression level to be controlled, as well as allowing for more options with regard to complementation, co- and super-transformation. Finally, the vectors share standardized cloning sites, allowing a gene of interest to be easily transfered between the different versions of the vectors as experimental requirements evolve. The organisation and dynamics of the Dictyostelium nucleus during the cell cycle was investigated. The centromeric histone H3 (CenH3) variant serves to target the kinetochore to the centromeres and thus ensures correct chromosome segregation during mitosis and meiosis. A number of Dictyostelium histone H3-domain containing proteins as GFP-tagged fusions were expressed and it was found that one of them functions as CenH3 in this species. Like CenH3 from some other species, Dictyostelium CenH3 has an extended N-terminal domain with no similarity to any other known proteins. The targeting domain, comprising α-helix 2 and loop 1 of the histone fold is required for targeting CenH3 to centromeres. Compared to the targeting domain of other known and putative CenH3 species, Dictyostelium CenH3 has a shorter loop 1 region. The localisation of a variety of histone modifications and histone modifying enzymes was examined. Using fluorescence in situ hybridisation (FISH) and CenH3 chromatin-immunoprecipitation (ChIP) it was shown that the six telocentric centromeres contain all of the DIRS-1 and most of the DDT-A and skipper transposons. During interphase the centromeres remain attached to the centrosome resulting in a single CenH3 cluster which also contains the putative histone H3K9 methyltransferase SuvA, H3K9me3 and HP1 (heterochromatin protein 1). Except for the centromere cluster and a number of small foci at the nuclear periphery opposite the centromeres, the rest of the nucleus is largely devoid of transposons and heterochromatin associated histone modifications. At least some of the small foci correspond to the distal telomeres, suggesting that the chromosomes are organised in a Rabl-like manner. It was found that in contrast to metazoans, loading of CenH3 onto Dictyostelium centromeres occurs in late G2 phase. Transformation of Dictyostelium with vectors carrying the G418 resistance cassette typically results in the vector integrating into the genome in one or a few tandem arrays of approximately a hundred copies. In contrast, plasmids containing a Blasticidin resistance cassette integrate as single or a few copies. The behaviour of transgenes in the nucleus was examined by FISH, and it was found that low copy transgenes show apparently random distribution within the nucleus, while transgenes with more than approximately 10 copies cluster at or immediately adjacent to the centromeres in interphase cells regardless of the actual integration site along the chromosome. During mitosis the transgenes show centromere-like behaviour, and ChIP experiments show that transgenes contain the heterochromatin marker H3K9me2 and the centromeric histone variant H3v1. This clustering, and centromere-like behaviour was not observed on extrachromosomal transgenes, nor on a line where the transgene had integrated into the extrachromosomal rDNA palindrome. This suggests that it is the repetitive nature of the transgenes that causes the centromere-like behaviour. A Dictyostelium homolog of DET1, a protein largely restricted to multicellular eukaryotes where it has a role in developmental regulation was identified. As in other species Dictyostelium DET1 is nuclear localised. In ChIP experiments DET1 was found to bind the promoters of a number of developmentally regulated loci. In contrast to other species where it is an essential protein, loss of DET1 is not lethal in Dictyostelium, although viability is greatly reduced. Loss of DET1 results in delayed and abnormal development with enlarged aggregation territories. Mutant slugs displayed apparent cell type patterning with a bias towards pre-stalk cell types.Für die Überexpression markierter Proteine in Dictyostelium discoideum wurde eine Serie von Konstrukten kloniert und getestet. Diese Vektoren ermöglichen die Fusion von N- oder C-terminalen Tags (GFP, RFP, 3xFLAG, 3xHA, 6xMYC und TAP). Sie beinhalten eine optimierte Polylinker-Sequenz und haben keine zusätzlichen Aminosäuren zwischen dem Tag und dem Gen von Interesse. Außerdem sind verschiedenen Selektionsmarker (Blasticidin und Geniticin) verfügbar. Darüber hinaus gibt es extrachromosomale Versionen der Vektoren, die in bestimmter Kopienzahl vorliegen und somit ein kontrollierbares Expressionslevel der Zielproteine in D. discoideum erlauben. Diese Vektoren können im Hinblick auf Komplementation, Co- und Supertransformation flexibel eingesetzt werden. Schließlich haben die Vektoren standardisierte Restriktionsschnittstellen, die für die Klonierung genutzt werden können. Das Gen von Interesse kann in Abhängigkeit von den experimentellen Anforderungen leicht in verschiedene Vektoren eingebracht werden. Die Organisation und Dynamik des D. discoideum Zellkerns wurde während des Zell-Zyklus untersucht. Es ist bekannt, dass die Zentromer spezifische Variante des Histons H3 (CenH3) als Ansatzpunkt des Kinetochors am Zentromer dient und ermöglicht so die korrekte Verteilung der Chromosomen während der Mitose und der Meiose. Eine Reihe endogene Dictyostelium Proteinen, die eine Histon H3-Domäne besitzen, wurden als GFP-markierte Fusionsproteine exprimiert. Es stellte sich heraus, dass eines dieser Proteinee Verhalten verantwortlich ist. In D. discoideum konnte ein Homolog von DET1 nachgewiesen werden. DET1 Homologe sind nur von multizellulären Eukaryoten bekannt, wo sie eine Rolle in der Entwicklungsregulation spielen. Wie auch in anderen Spezien ist das DET1-Homolog in Dictyostelium im Zellkern lokalisiert. In ChIP Experimenten zeigte sich, dass DET1 an Promotoren bindet, die in der Entwicklung reguliert werden. Im Gegensatz zu anderen Organismen ist der DET1-Knockout nicht lethal, wobei die Lebensfähigkeit der KO Zellen sehr beeinträchtigt ist. Der Verlust von DET1 führt zu Störungen in der Entwicklung von D. discoideum, wobei vergrößerte Aggregatzonen gebildet werden. CenH3-Funktion hat. Genau wie CenH3-Proteine in anderen Organismen besitzt das Dictyostelium-Homolog eine erweiterte N-terminale Domäne, die keine Ähnlichkeit zu anderen Proteinen zeigt. Die Α-Helix 1 und der Loop 1 der N-terminale Domäne werden für die Bindung von CenH3 am Zentromer benötigt. Im Gegensatz zu bekannten und putativen CenH3-Homologen ist die Loop 1-Region bei dem D. discoideum Homolog verkürzt. Die Lokalisation von Histonen mit bestimmten Modifikationen sowie der modifizierenden Enzyme wurden untersucht. Mit Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und CenH3 Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) konnte gezeigt werden, dass alle sechs telozentrischen Zentromere DIRS-1 und die meisten DDT-A und Skipper Transposons beinhalten. In der Interphase sind die Zentromere an dem Zentrosom gebunden, wodurch sich ein einzelner CenH3 perizentromerischer Cluster ergibt. Dieses Cluster umfasst die putative H3K9 Methyltransferase SuvA, H3K9me3 und HP1 (Heterochromatin Protein 1). Abgesehen vom zentromeren Cluster und einer Anzahl von kleinen Bereichen an der Peripherie des Nukleus gegenüber der Zentromere ist der Nukleus frei von Transposons und Histonmodifikationen, die auf Heterochromatin schließen lassen. Einige der eben angesprochenen Bereiche stimmen mit den distalen Telomeren überein, was die Vermutung nahe legt, dass die Organisation der Chromosomen ein RabI-ähnliches Verhalten zeigt. Im Gegensatz zu Metazoaen konnte gezeigt werden, dass die Beladung der Dictyostelium Zentromere mit CenH3 in der späten G2-Phase statt findet. Die Transformation von Dictyostelium mit Vektoren, die eine G418 Resistenz Kassette tragen, führt typischerweise zu einer Integration der Vektoren in das Genom von D. discoideum. Dabei integiert der Vektor in einem oder wenigen repetitiven Clustern von ungefähr ein hundert Kopien. Im Gegensatz dazu integiert ein Plasmid mit einer Blasticidin Resistenz Kassette nur einmal oder in wenigen Kopien in das Genom von D. discoideum. Das Verhalten der Transgene im Zellkern wurde mit Hilfe von FISH untersucht und es wurde festgestellt, dass sie mit einer niedrigen Kopienzahl zufällig über den ganzen Nukleus verteilt sind. Im Gegensatz dazu integieren Transgene mit einer Kopienzahl von mehr als 10 in Clustern im oder nahe dem Zentromer in Interphase Zellen. Während der Mitose zeigen die Transgene ein zentromer-ähnliches Verhalten. In ChIP Experimenten zeigte sich, dass die Transgene sowohl den Euchromatin Zeiger H3K4me3 wie auch den Heterochromatin Zeiger H3k9me2 und die zentromerische Histonvariante H3v1 besitzen. Repetitive Cluster und das zentromer-ähnliche Verhalten konnten weder bei extrachromosomalen Transgenen noch bei Stämmen festgestellt werden, bei denen die Transgene in das extrachromosomale rDNA Palindrom integriert sind. Das legt die Vermutung nahe, dass die repetitive Natur der Transgene für das zentromer-ähnlich
URI: urn:nbn:de:hebis:34-2010060433111
Sammlung(en):Dissertationen

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