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KOBRA - Dokumentenserver der Universität Kassel  → Fachbereiche  → FB 10 / Mathematik und Naturwissenschaften  → Institut für Biologie  → Fachgebiet Zellbiologie  → Dissertationen 

Please use this identifier to cite or link to this item: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:hebis:34-2011011935433

Title: Unveiling the components of the signaling pathway between endosomes and the phagocytic uptake machinery in Dictyostelium discoideum
Authors: Konotop, Gleb
???metadata.dc.subject.swd???: PhagozytoseDictyostelium discoideumEndocytose
???metadata.dc.subject.ddc???: 500 - Naturwissenschaften (Natural sciences and mathematics)
Issue Date: 19-Jan-2011
Abstract: The soil amoebae Dictyostelium discoideum take up particles from their environment in order to obtain nutrition. The particle transits through the cell within a phagosome that fuses with organelles of different molecular compositions, undergoing a gradual degradation by different sets of hydrolytic enzymes. Griffiths’ concept of “phagosome individuality” predicts signaling from phagosomes into the cytoplasm, which might regulate many aspects of cell physiology. The finding that Dictyostelium cells depleted of the lysozyme AlyA or over-expressing the esterase Gp70 exhibit increased uptake of food particles, led to the postulation of a signaling cascade between endocytic compartments and the cytoskeletal uptake machinery at the plasma membrane. Assuming that Gp70 acts downstream of AlyA, gene-expression profiling of both mutants revealed different and overlapping sets of misregulated genes that might participate in this signaling cascade. Based on these results, we analyzed the effects of the artificial misregulation of six candidate genes by over-expression or negative genetic interference, in order to reconstruct at least part of the signaling pathway. SSB420 and SSL793 were chosen as candidates for the first signaling step, as they were up-regulated in AlyA-null cells and remained unaltered in the Gp70 over-expressing cells. The over-expression of SSB420 enhanced phagocytosis and raised the expression levels of Gp70, supporting its involvement in the signaling pathway between AlyA and Gp70 as a positive regulator of phagocytosis. However, this was not the case of cells over-expressing SSL793, as this mutation had no effects on phagocytosis. For the signaling downstream of Gp70, we studied four commonly misregulated genes in AlyA-depleted and Gp70 over-expressing cells. The expression levels of SLB350, SSB389 and TipD were lower in both mutants and therefore these were assumed as possible candidates for the negative regulation of phagocytosis. Cells depleted of SLB350 exhibited an increased phagocytic activity and no effect on Gp70 expression, proving its participation in the signaling pathway downstream of Gp70. Unlike SLB350, the disruption of the genes coding for SSB389 and TipD had no effects on particle uptake, excluding them from the pathway. The fourth candidate was Yipf1, the only gene that was commonly up-regulated in both mutants. Yet, the artificial over-expression of this protein had no effects on phagocytosis, so this candidate is also not included in the signaling pathway. Furthermore, localizing the products of the candidate genes within the cell helped unveiling several cellular organelles that receive signals from the phagosome and transduce them towards the uptake machinery.Zur Nahrungsaufnahme endozytiert die Bodenamöbe Dictyostelium discoideum Partikel aus ihrer Umgebung. Die Partikel passieren die Zelle in einem Phagosom, welches mit anderen Organellen verschiedener molekularer Ausstattung fusioniert. Dies führt zur allmählichem Degradierung der Partikel durch verschiedene Sets hydrolytischer Enzyme. Das Konzept von Griffiths sagt voraus, dass individuelle Phagosomen regulatorische Signale an das Zytoplasma aussenden. Da sowohl das Fehlen des Lysozyms AlyA als auch die Überexpression der Esterase Gp70 zu eine Steigerung der Partikelaufnahme führten, wurde eine Signalkaskade zwischen den Phagosomen und dem Ort der Partikelaufnahme an der Plasmamembran postuliert. Ausgehend von der Tatsache, dass Gp70 unterhalb von AlyA wirkt, wurden Genexpressions-Analysen mit beiden Mutanten durchgeführt. Daraus gingen mehrere Gene hervor, die ebenfalls im Signalweg involviert sein könnten. Sechs der Gene wurden für weitere Experimente ausgewählt. Um ihren Einfluss auf die Phagozytose zu untersuchen, wurde die Expression der Gene gezielt erhöht oder verringert. Dabei sollte der bisher unbekannte Weg des Signals, welches ausgehend vom Phagosom die Steuerung der Partikelaufnahme reguliert, schrittweise rekonstruiert werden. Zur Untersuchung des ersten Segments des Signalwegs, zwischen AlyA und Gp70, wurden SSB420 und SSL793 ausgesucht. Beide Proteine werden in den AlyA-Knockout-Zellen verstärkt exprimiert, jedoch nicht in Gp70-Überexprimierern. Die Überexpression von SSB420 hatte sowohl einen positiven Effekt auf die Phagocytose als auch auf die Expression von Gp70. Dies bestätigte die Rolle von SSB420 in der Signalkaskade als ein positiver Regulator der Partikelaufnahme. Die Überexpression von SSL793 rief jedoch keinen Phänotyp hervor. Neben den bereits genannten, wurden vier weitere Proteine ausgewählt: Drei wurden in den AlyA- und Gp70-Mutanten schwächer exprimiert und ein Protein wies eine erhöhte Expression auf. Der Knockout von SLB350 hatte eine positive Wirkung auf die Phagozytose und beeinflusste die Expression von Gp70 nicht. Dieses Ergebnis lässt auf eine negative regulatorische Rolle von SLB350 im zweiten Segment der Signalkaskade, also unterhalb von Gp70, schließen. Anders als bei SLB350, riefen weder die Knockouts von SSB389 und TipD, noch die Überexpression von Yipf1 eine Veränderung der Patikelaufnahme hervor. Anhand der subzellulären Lokalisation der hier untersuchten Proteine konnten sowohl die zelluläre Organellen die von AlyA Phagosom Signale epmfingen, als auch solche, die Signale an den Ort der Partikelaufnahme weiterleiten, identifiziert werden.
URI: urn:nbn:de:hebis:34-2011011935433
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