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KOBRA - Dokumentenserver der Universität Kassel  → Fachbereiche  → FB 10 / Mathematik und Naturwissenschaften  → Institut für Biologie  → Fachgebiet Biochemie  → Dissertationen 

Please use this identifier to cite or link to this item: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:hebis:34-2012032841015

Title: Untersuchungen zur Rolle von Isoformen katalytischer Untereinheiten der PKA
Authors: Badel, Antje
???metadata.dc.subject.swd???: Proteinkinase AYeast-Two-Hybrid-SystemSignaltransduktion
???metadata.dc.subject.ddc???: 500 - Naturwissenschaften (Natural sciences and mathematics)570 - Biowissenschaften, Biologie (Life sciences)
Issue Date: 28-Mar-2012
Abstract: ZUSAMMENFASSUNG: Proteinkinasen übernehmen zentrale Aufgaben in der Signaltransduktion höherer Zellen. Dabei ist die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) bezüglich ihrer Struktur und Funktion eine der am besten charakterisierten Proteinkinasen. Trotzdem ist wenig über direkte Interaktionspartner der katalytischen Untereinheiten (PKA-C) bekannt. In einem Split-Ubiquitin basiertem Yeast Two Hybrid- (Y2H-)System wurden potenzielle Interaktionspartner der PKA-C identifiziert. Als Bait wurden sowohl die humane Hauptisoform Cα (hCα) als auch die Proteinkinase X (PrKX) eingesetzt. Nach der Bestätigung der Funktionalität der PKA-C-Baitproteine, dem Nachweis der Expression und der Interaktion mit dem bekannten Interaktionspartner PKI wurde ein Y2H-Screen gegen eine Mausembryo-cDNA-Expressionsbibliothek durchgeführt. Von 2*10^6 Klonen wurden 76 Kolonien isoliert, die ein mit PrKX interagierendes Preyprotein exprimierten. Über die Sequenzierung der enthaltenen Prey-Vektoren wurden 25 unterschiedliche, potenzielle Interaktionspartner identifiziert. Für hCα wurden über 2*10^6 S. cerevisiae-Kolonien untersucht, von denen 1.959 positiv waren (1.663 unter erhöhter Stringenz). Über die Sequenzierung von ca. 10% der Klone (168) konnten Sequenzen für 67 verschiedene, potenzielle Interaktionspartner der hCα identifiziert werden. 15 der Preyproteine wurden in beiden Screens identifiziert. Die PKA-C-spezifische Wechselwirkung der insgesamt 77 Preyproteine wurde im Bait Dependency Test gegen largeT, ein Protein ohne Bezug zum PKA-System, untersucht. Aus den PKA-C-spezifischen Bindern wurden die löslichen Preyproteine AMY-1, Bax72-192, Fabp3, Gng11, MiF, Nm23-M1, Nm23-M2, Sssca1 und VASP256-375 für die weitere in vitro-Validierung ausgewählt. Die Interaktion von FLAG-Strep-Strep-hCα (FSS-hCα) mit den über Strep-Tactin aus der rekombinanten Expression in E. coli gereinigten One-STrEP-HA-Proteinen (SSHA-Proteine) wurde über Koimmunpräzipitation für SSHA-Fabp3, -Nm23-M1, -Nm23-M2, -Sssca1 und -VASP256-375 bestätigt. In SPR-Untersuchungen, für die hCα kovalent an die Oberfläche eines CM5-Sensorchips gekoppelt wurde, wurden die ATP/Mg2+-Abhängigkeit der Bindungen sowie differentielle Effekte der ATP-kompetitiven Inhibitoren H89 und HA-1077 untersucht. Freie hCα, die vor der Injektion zu den SSHA-Proteinen gegeben wurde, kompetierte im Gegensatz zu FSS-PrKX die Bindung an die hCα-Oberfläche. Erste kinetische Analysen lieferten Gleichgewichtsdissoziationskonstanten im µM- (SSHA-Fabp3, -Sssca1), nM- (SSHA-Nm23-M1, –M2) bzw. pM- (SSHA-VASP256-375) Bereich. In funktionellen Analysen konnte eine Phosphorylierung von SSHA-Sssca1 und VASP256-375 durch hCα und FSS-PrKX im Autoradiogramm nachgewiesen werden. SSHA-VASP256-375 zeigte zudem eine starke Inhibition von hCα im Mobility Shift-Assay. Dieser inhibitorische Effekt sowie die hohe Affinität konnten jedoch auf eine Kombination aus der Linkersequenz des Vektors und dem N-Terminus von VASP256-375 zurückgeführt werden. Über die Wechselwirkungen der hier identifizierten Interaktionspartner Fabp3, Nm23-M1 und Nm23-M2 mit hCα können in Folgeuntersuchungen neue PKA-Funktionen insbesondere im Herzen sowie während der Zellmigration aufgedeckt werden. Sssca1 stellt dagegen ein neues, näher zu charakterisierendes PKA-Substrat dar.SUMMARY: Protein kinases are key regulators in fundamental signal transduction processes in eukaryotic cells. In this context, cAMP dependent protein kinase (PKA) is – respective to structure and function – one of the best characterised protein kinases. Nevertheless, little is known about direct interaction partners of its catalytic subunits (PKA-C). A split-ubiquitin based yeast two hybrid- (Y2H-) system was used to identify potential interaction partners of PKA-C. Both, the human major isoform Cα (hCα) and protein kinase X (PrKX) were applied as bait. After validation of their functionality, expression as well as their interaction with the known interaction partner PKI in yeast, an Y2H screen against a cDNA expression library from mouse embryo was performed. 76 out of 2*10^6 clones expressed an interacting prey. Sequencing of the prey vectors identified 25 different, potential interaction partners. In addition, over 2*10^6 S. cerevisiae colonies were screened for hCα. 1.959 of them were positive for bait prey interaction (1.663 under higher stringency). Sequencing of about 10% of these clones (168) provided sequences for 67 distinct, potential interaction partners of hCα. 15 prey proteins were identified in both screens. PKA-C specific interaction was analysed in a bait dependency test against the unrelated protein largeT as control. The soluble PKA-C specific candidates AMY-1, Bax72-192, Fabp3, Gng11, MiF, Nm23-M1, Nm23-M2, Sssca1 and VASP256-375 were chosen for further in vitro validation. These proteins were expressed as One-STrEP-HA- (SSHA-)proteins in E. coli and purified via Strep-Tactin. The interaction of FLAG-Strep-Strep-hCα (FSS-hCα) with SSHA-Fabp3, -Nm23-M1, -Nm23-M2, -Sssca1 and -VASP256-375 was confirmed by co-immunoprecipitation. In SPR experiments, in which hCα was covalently coupled to the surface of a CM5 sensor chip, the ATP/Mg2+ dependency of the binding and differential effects of the ATP competitive inhibitors H89 and HA-1077 were examined. Free hCα but not free FSS-PrKX competed for the binding of SSHA-proteins to the hCα sensor chip. In kinetic analyses, KD values in the µM- (SSHA-Fabp3, -Sssca1), nM- (SSHA-Nm23-M1, –M2) and pM- (SSHA-VASP256-375) range, respectively, were measured. In functional assays, a phosphorylation of SSHA-Sssca1 and -VASP256-375 by hCα as well as FSS-PrKX was detected in autoradiographs. In addition, SSHA-VASP256-375 strongly inhibited the catalytic activity of hCα in a mobility shift assay. Both, the inhibitory effect and the high affinity were attributed to an artificial recognition sequence resulting from combination of the linker sequence of the used vector and the N-terminus of VASP256-375. Concerning the interplay of hCα with the here identified interaction partners Fabp3, Nm23-M1 and Nm23-M2, this work established a basis for further research which might help to detect new PKA functions especially in the heart and during cell migration. In addition, Sssca1 was identified as a new PKA substrate to be characterised in more detail.
URI: urn:nbn:de:hebis:34-2012032841015
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