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KOBRA - Dokumentenserver der Universität Kassel  → Fachbereiche  → FB 10 / Mathematik und Naturwissenschaften  → Institut für Biologie  → Fachgebiet Mikrobiologie  → Dissertationen 

Please use this identifier to cite or link to this item: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:hebis:34-2013070542926

Title: Untersuchungen zur Biofilmbildung bei dem klinischen Isolat Enterococcus faecalis 1.10
Authors: Eichler, Christian
???metadata.dc.subject.swd???: PiliEnterococcusBiofilm
???metadata.dc.subject.ddc???: 500 - Naturwissenschaften (Natural sciences and mathematics)
Issue Date: 5-Jul-2013
Abstract: In der vorliegenden Arbeit wurde die Biofilmbildung bei einem klinischen Isolat von Enterococcus faecalis untersucht. Der Prozess der Biofilmbildung ist in mehrere Abschnitte unterteilt und beinhaltet zu Beginn eine Anhaftung von Zellen an Oberflächen. Dieser adhäsive Schritt wird unter anderem durch Pili vermittelt. Pili bei Grampositiven Mikroorganismen sind kovalent mit der Zellwand verknüpfte Proteinstrukturen, die eine Anheftung an biotische und abiotische Oberflächen sowie den Zell-Zell-Kontakt vermitteln. Bei den Analysen dieser Doktorarbeit lag ein besonderes Interesse bei eben diesen Pili, die für Enterococcus faecalis die Namen Ebp (endocarditis and biofilm associated pili) und Bee (biofilm enhancer in enterococci) tragen. Codiert werden sie durch die entsprechenden ebp-/bee-Loci, deren Aufbau unter den Grampositiven Mikroorganismen hochkonserviert ist. Die Loci bestehen aus Pilusuntereinheiten-codierenden Genen und colokalisierten Pilus-spezifischen Sortase Genen. Während in der Regel drei verschiedene Pilusuntereinheiten vorliegen, kann die Anzahl der Sortasen zwischen einer und zwei variieren. Bei den Experimenten wurde neben einer Komplementationsstudie zu einer Bee-Pilus Defekt-Mutante (1.10.16) das Hauptaugenmerk auf die Analyse des zweiten Pilus (Ebp) gelegt, um die Pilisituation bei Isolat 1.10 im Detail darzustellen Zusätzlich sollten weitere Oberflächenassoziierte Proteinstrukturen bei Isolat 1.10 detektiert werden, die gegebenenfalls an der Biofilmbildung beteiligt sind. Weitere Versuche zur Charakterisierung des Bee-Pilus wurden im Laufe dieser Arbeit durchgeführt, blieben jedoch bisher erfolglos. Die Biofilm-/Pilus-Defekt-Mutante 1.10.16 zeigte aufgrund einer Punktmutation (Pm) in der Pilus-spezifischen Sortase 1 des bee-Locus eine geschwächte Fähigkeit zur Anheftung an abiotische Oberflächen, sowie das Fehlen der Bee2 Untereinheit im Pilus. Nach Komplementation der Mutante (1.10.16K) mit dem Wildtyp-srt1 Gen, wurde die starke Biofilmbildungsfähigkeit zurück erlangt. Die Experimente zeigten, dass der Pilus-Defekt auf die Pm im srt1 Gen zurückzuführen war und der Bee-Pilus in Stamm 1.10.16K wieder korrekt gebildet wurde. Zu sehen war dies in Rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen und ebenfalls im massenspektrometrischen Nachweis aller 3 Pilusuntereinheiten im Bee-Pilus charakteristischen High-Molecular-Weight Komplex (~ 250 kDa). Durch Sequenzierungen konnte gezeigt werden, dass zwei Gene des ebp-Locus (ebpR und ebpC) bei Isolat 1.10 durch die Insertion von IS-Elementen IS1062 und IS6770 inaktiviert wurden. Der proteinbiochemische Nachweis über Pilusspezifische Antikörper gegen die Untereinheiten des Ebp-Pilus verlief negativ. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die mRNA der beiden inaktivierten Gene nicht gebildet wurde. Dies führte folglich zum vollständigen Verlust des Ebp-Pilus bei Isolat 1.10. Zusammen mit den Ergebnissen der Komplementation konnte somit der große Einfluss mindestens eines intakten Pilus auf die Biofilmbildung gezeigt werden. Sind beide Pili durch Insertionen bzw. Mutationen inaktiviert, kommt es zu einer deutlichen Abnahme der Biofilmbildungsstärke. Dass trotzdem noch ein Biofilm gebildet wurde, zeigt den multifaktoriellen Zusammenhang bzw. Einfluss im Biofilmbildungsprozess. Über das gezielte Markieren von Oberflächenproteinen intakter Zellen mittels der Oberflächenbiotinylierung, konnten in der SDS-PAGE Unterschiede im Bandenmuster im Vergleich zur unbehandelten Probe erkannt werden. Die massenspektrometrische Identifikation dieser Proteine erfolgte bisher nicht, jedoch sind diese vorläufigen Ergebnisse vielversprechender Natur für die Identifikation und Aufklärung der Oberflächenproteinsituation bei Isolat 1.10.The major focus of this thesis was on the biofilm formation of a clinical isolate (1.10) of Enterococcus faecalis. In the multistep process of biofilm formation, we were particularly interested in the involvement of the two known pili Ebp (endocarditis and biofilm associated pilus) and Bee (biofilm enhancer in enterococci) for Enterococcus faecalis, which are encoded by their specific ebp-Locus, respectively bee-locus. The pili usually are composed of three pilin subunits, which together form the mature pilus. The number of the colocalized sortases can differ between one and two and are responsible for the covalently assemble and cell wall linkage of this surface protein structures to the cell wall. In addition to their conferment of direct cell-cell contact, also adhesion to many biotic and abiotic surfaces are mediated by pili and hence initiate the biofilm formation process. Beside the complementation experiments for an isogenic biofilm defective mutant (1.10.16) of isolate 1.10, the experiments were focused on the analysis of the second Ebp-pilus, to get a clearer view of the pili situation of isolate 1.10. In addition some efforts were done in the detection of additional surface protein structures of isolate 1.10, which may contribute to the biofilm formation process. In another set of experiments further investigations were performed to get a better understanding of Bee-pilus assembly, but without any success so far. The biofilm defective mutant 1.10.16 showed a point mutation (pm) in the srt1 gene of the bee-locus and therefor lost its ability to form a correct pilus (loss of subunit Bee2 in the high molecular weight complex (~ 250 kDa) confirmed by mass spectrometry) followed by a decrease in biofilm formation strength. Complementation of the mutant 1.10.16 with wildtyp srt1 gene restored the strong biofilm formation ability in resulting strain 1.10.16K and all three subunits of the Bee-pilus could be detected again by mass spectrometry. In addition specific surface structures could be observed by raster electron microscopy (REM) in isolate 1.10 and complemented strain 1.10.16K, but were absent in mutant 1.10.16. All this results showed and proved the successful complementation of mutant 1.10.16. Sequencing genes of the Ebp-pilus showed the inactivation of two genes of the ebp-locus by insertion of IS elements IS1062 and IS6770, which results in loss of the complete Ebp-pilus proven by negative results for isolate 1.10 in western blotting against the three subunits of Ebp. In addition it was shown that the defect took place at transcription level by negative results for the corresponding mRNAs. Taken these results together with the Bee-pilus experiments, we have shown the necessity of at least one intact pilus for strong biofilm formation. Weak biofilm formation of the double pilus negative mutant 1.10.16 showed the involvement of multiple factors in the biofilm formation process. By biotinylation of surface protein structures from intact cells of isolate 1.10, we could detect several proteins in SDS-PAGE, which have to be further identified and investigated. These proteins are promising candidates, which are may be involved in biofilm formation of isolate 1.10.
URI: urn:nbn:de:hebis:34-2013070542926
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