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KOBRA - Dokumentenserver der Universität Kassel  → Fachbereiche  → FB 10 / Mathematik und Naturwissenschaften  → Institut für Biologie  → Fachgebiet Entwicklungsgenetik  → Dissertationen 

Please use this identifier to cite or link to this item: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:hebis:34-2014091246008

Title: Zelluläre und biochemische Charakterisierung der bifunktionalen Methyltransferase Dnmt2
Authors: Windhof-Jaidhauser, Indra Maria
???metadata.dc.subject.swd???: Dictyostelium discoideumMethylierungDNS-Methyltransferase
???metadata.dc.subject.ddc???: 570 - Biowissenschaften, Biologie (Life sciences)
Issue Date: 12-Sep-2014
Abstract: Seit der Entdeckung der Methyltransferase 2 als hoch konserviertes und weit verbreitetes Enzym sind zahlreiche Versuche zur vollständigen Charakterisierung erfolgt. Dabei ist die biologische Funktion des Proteins ein permanent umstrittener Punkt. In dieser Arbeit wird dnmA als sensitiver Oszillator bezüglich des Zellzyklus und weiterer Einflüsse gezeigt. Insgesamt liegt der Hauptfokus auf der Untersuchung der in vivo Charakterisierung des Gens, der endogenen subzellulären Verteilung, sowie der physiologischen Aufgaben des Proteins in vivo in D. discoideum. Um Hinweise auf Signalwege in vivo zu erhalten, in denen DnmA beteiligt ist, war es zunächst notwendig, eine detaillierte Analyse des Gens anzufertigen. Mit molekularbiologisch äußerst sensitiven Methoden, wie beispielsweise Chromatin‐IP oder qRT‐PCR, konnte ein vollständiges Expressionsprofil über den Zell‐ und Lebenszyklus von D. discoideum angelegt werden. Besonders interessant sind dabei die Ergebnisse eines ursprünglichen Wildtypstammes (NC4), dessen dnmA‐Expressionsprofil quantitativ von anderen Wildtypstämmen abweicht. Auch auf Proteinebene konnten Zellzyklus‐abhängige Effekte von DnmA bestimmt werden. Durch mikroskopische Untersuchungen von verschiedenen DnmA‐GFP‐Stämmen wurden Lokalisationsänderungen während der Mitose gezeigt. Weiterhin wurde ein DnmA‐GFP‐Konstrukt unter der Kontrolle des endogenen Promotors generiert, wodurch das Protein in der Entwicklung eindeutig als Zelltypus spezifisches Protein, nämlich als Präsporen‐ bzw. Sporenspezifisches Protein, identifiziert werden konnte. Für die in vivo Analyse der katalytischen Aktivität des Enzyms konnten nun die Erkenntnisse aus der Charakterisierung des Gens bzw. Proteins berücksichtigt werden, um in vivo Substratkandidaten zu testen. Es zeigte sich, dass von allen bisherigen Substrat Kandidaten lediglich die tRNA^Asp als in vivo Substrat bestätigt werden konnte. Als besondere Erkenntnis konnte hierbei ein quantitativer Unterschied des Methylierungslevels zwischen verschiedenen Wildtypstämmen detektiert werden. Weiterhin wurde die Methylierung sowie Bindung an einen DNA‐Substratkandidaten ermittelt. Es konnte gezeigt werden, dass DnmA äußerst sequenzspezifisch mit Abschnitten des Retrotransposons DIRS‐1 in vivo eine Bindung eingeht. Auch für den Substrakandidaten snRNA‐U2 konnte eine stabile in vitro Komplexbildung zwischen U2 und hDnmt2 gezeigt werden. Insgesamt erfolgte auf Basis der ermittelten Expressionsdaten eine erneute Charakterisierung der Aktivität des Enzyms und der Substrate in vivo und in vitro.Since the discovery of Methyltransferase 2 as a highly conserved and widely distributed enzyme, much effort on the complete characterization of the enzyme has been done. The functionality of the protein is a highly discussed point. In this thesis, dnmA is shown as a sensitive oscillator regarding the cell cycle and other environmental conditions. The aim of this research is the in vivo characterization of the gene as well as the endogenous subcellular distribution and the physiological in vivo function of the protein in D. discoideum. In order to demonstrate involvement of dnmA in biological pathways, a detailed analysis of the gene was necessary. With help of highly sensitive molecular methods like Chromatin IP or qRT‐PCR a complete expression profile of D. discoideums development‐ and cell cycle has been done. Particullarly interesting in this regard are the the results of the wildtype (NC4), where the expression profile differs quantitatively from other wildtype strains. Cell‐cyle dependent effects of DnmA were also found at the protein level. Microscopic analysis of different DnmA‐GFP strains detected changes in localization during mitosis. In this work, a construct was generated which expresses dnmA under the control of the endogenous promoter. Thus, the protein has been shown as a cell‐type specific protein during development; i.e. it was identified as a Prespore and subsequently as Spore specific protein. For the analysis of the in vivo function of the protein, this work considered the results from gene and/or protein characterization in order to test in vivo substrate candidates and further to identify the mechanism that causes differences in enzyme activity. It became evident that of all the substrate candidates, only tRNA^Asp could be confirmed as an in vivo substrate. Surprisingly, a quantitative difference is detected in the methylation level between different wildtype strains. Thus, this result is the first analysis regarding the differences in methylation activity of wildtype strains. It was shown in vivo that DnmA has a highlysequence‐specific interaction with parts of the retrotransposon DIRS‐1. Thus, this region could not be characterized as a methylation substrate but as a partner for DnmA binding. Also for the non tRNA substrate candidate snRNA U2 a stably bound in vitro complex between U2 and hDnmt2 is shown. In conclusion, based on the identified expression data a new characterization of the substrates of the Dnmt2 homolog, DnmA, has been done in vivo and in vitro.
URI: urn:nbn:de:hebis:34-2014091246008
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