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KOBRA
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KOBRA - Dokumentenserver der Universität Kassel  → Fachbereiche  → FB 10 / Mathematik und Naturwissenschaften  → Institut für Biologie  → Fachgebiet Tierphysiologie  → Dissertationen 

Please use this identifier to cite or link to this item: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:hebis:34-2015101449134

Title: Physiological analysis of central and peripheral insect circadian pacemaker neurons
Other Titles: Accessory medulla neurons of the Madeira cockroach Rhyparobia maderae and olfactory receptor neurons of the hawkmoth Manduca sexta
Authors: Funk, Nico Werner
???metadata.dc.subject.swd???: Leucophaea maderaeManduca sextaBiologische UhrTagesrhytmusSchrittmacher
???metadata.dc.subject.ddc???: 500 - Naturwissenschaften (Natural sciences and mathematics)570 - Biowissenschaften, Biologie (Life sciences)
Issue Date: 14-Oct-2015
Abstract: Alle bisher untersuchten Lebewesen besitzen (circadiane) innere Uhren, die eine endogene Perioden-länge von ungefähr 24 Stunden generieren. Eine innere Uhr kann über Zeitgeber mit der Umwelt synchronisiert werden und ermöglicht dem Organismus, rhythmische Umweltveränderungen vorweg zu nehmen. Neben einem zentralen Schrittmacher, der Physiologie und Verhalten des Organismus steuert, gibt es in unterschiedlichen Organen auch periphere Uhren, die die zeitlichen Abläufe in der spezifischen Funktion dieser Organe steuern. In dieser Arbeit sollten zentrale und periphere Schrittmacherneurone von Insekten physiologisch untersucht und verglichen werden. Die Neurone der akzessorischen Medulla (AME) von Rhyparobia maderae dienten als Modellsystem für zentrale Schrittmacher, während olfaktorische Rezeptorneurone (ORNs) von Manduca sexta als Modellsystem für periphere Schrittmacher dienten. Die zentralen Schrittmacherneurone wurden in extrazellulären Ableitungen an der isolierten AME (Netzwerkebene) und in Patch-Clamp Experimenten an primären AME Zellkulturen (Einzelzellebene) untersucht. Auf Netzwerkebene zeigten sich zwei charakteristische Aktivitätsmuster: regelmäßige Aktivität und Wechsel zwischen hoher und niedriger Aktivität (Oszillationen). Es wurde gezeigt, dass Glutamat ein Neurotransmitter der weitverbreiteten inhibitorischen Synapsen der AME ist, und dass in geringem Maße auch exzitatorische Synapsen vorkommen. Das Neuropeptid pigment-dispersing factor (PDF), das von nur wenigen AME Neuronen exprimiert wird und ein wichtiger Kopplungsfaktor im circadianen System ist, führte zu Hemmungen, Aktivierungen oder Oszillationen. Die Effekte waren transient oder langanhaltend und wurden wahrscheinlich durch den sekundären Botenstoff cAMP vermittelt. Ein Zielmolekül von cAMP war vermutlich exchange protein directly activated by cAMP (EPAC). Auf Einzelzellebene wurde gezeigt, dass die meisten AME Neurone depolarisiert waren und deshalb nicht feuerten. Die Analyse von Strom-Spannungs-Kennlinien und pharmakologische Experimente ergaben, dass unterschiedliche Ionenkanäle vorhanden waren (Ca2+, Cl-, K+, Na+ Kanäle sowie nicht-spezifische Kationenkanäle). Starke, bei hohen Spannungen aktivierende Ca2+ Ströme (ICa) könnten eine wichtige Rolle bei Ca2+-abhängiger Neurotransmitter-Ausschüttung, Oszillationen, und Aktionspotentialen spielen. PDF hemmte unterschiedliche Ströme (ICa, IK und INa) und aktivierte nicht-spezifische Kationenströme (Ih). Es wurde angenommen, dass simultane PDF-abhängige Hyper- und Depolarisationen rhythmische Membranpotential-Oszillationen verursachen. Dieser Mechanismus könnte eine Rolle bei PDF-abhängigen Synchronisationen spielen. Die Analyse peripherer Schrittmacherneurone konzentrierte sich auf die Charakterisierung des olfaktorischen Corezeptors von M. sexta (MsexORCO). In anderen Insekten ist ORCO für die Membran-Insertion von olfaktorischen Rezeptoren (ORs) erforderlich. ORCO bildet Komplexe mit den ORs, die in heterologen Expressionssystemen als Ionenkanäle fungieren und Duft-Antworten vermitteln. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass MsexORCO in pheromonsensitiven ORNs in vivo nicht als Teil eines ionotropen Rezeptors sondern als Schrittmacherkanal fungiert, der unterschwellige Membranpotential-Oszillationen generiert. MsexORCO wurde mit vermeintlichen Pheromonrezeptoren in human embryonic kidney (HEK 293) Zellen coexprimiert. Immuncytochemie und Ca2+ Imaging Experimente zeigten sehr schwache Expressionsraten. Trotzdem war es möglich zu zeigen, dass MsexORCO wahrscheinlich ein spontan-aktiver, Ca2+-permeabler Ionenkanal ist, der durch den ORCO-Agonisten VUAA1 und cyclische Nucleotide aktiviert wird. Außerdem wiesen die Experimente darauf hin, dass MsexOR-1 offensichtlich der Bombykal-Rezeptor ist. Eine weitere Charakterisierung von MsexORCO in primären M. sexta ORN Zellkulturen konnte nicht vollendet werden, weil die ORNs nicht signifikant auf ORCO-Agonisten oder -Antagonisten reagierten.Endogenous clocks can be found in almost all organisms, among them circadian clocks, which generate a period length of approximately 24 hours. These clocks are synchronized (entrained) with the environment and provide the organism with the ability to anticipate environmental changes. Next to the central circadian pacemaker (clock), which governs systemic behavioral and physiological rhythms, peripheral pacemakers can be found in a multitude of tissues, which control temporal processes in the function of the respective tissue. The aim of this thesis was a physiological characterization and comparison of central and peripheral insect circadian pacemaker neurons. Accessory medulla (AME) neurons of the cockroach Rhyparobia maderae were used as model system for central pacemaker neurons, and olfactory receptor neurons (ORNs) of Manduca sexta as model system for peripheral pacemaker neurons. Central pacemaker neurons were analyzed in extracellular recordings from the isolated AME (network level) and in patch clamp experiments performed with primary AME cell cultures (single cell level). At the network level, regular neuronal activity and changes of high- and low-activity phases (oscillations) were shown to be characteristic firing patterns. Glutamate was identified as neurotransmitter of the AME contributing to the widespread inhibitory synaptic interactions. To a lesser extent, excitatory synaptic interactions were also demonstrated. The neuropeptide pigment-dispersing factor (PDF), which is released by few AME neurons and functions as important coupling factor, caused inhibitions and activations, or it increased oscillations. Transient as well as long-lasting activity changes were detected, which were most probably mediated via the second messenger cAMP. The exchange protein directly activated by cAMP (EPAC) was suggested to be a possible target of cAMP. At the single cell level, AME neurons were shown to be depolarized and, thus, the majority remained silent. Analysis of current-voltage relationships and pharmacological treatment indicated the expression of different ion channels, such as Ca2+, Cl-, K+, Na+, and non-specific cation channels. Strong, high voltage-activated Ca2+ currents (ICa) were suggested to play an important role for Ca2+-dependent neurotransmitter release, oscillations, and spikes. PDF predominantly inhibited distinct currents (ICa, IK, and INa) but also activated non-specific cation currents (Ih), resulting in depolarizations as well as hyperpolarizations. It was hypothesized, that simultaneous depolarizing and hyperpolarizing effects cause rhythmic membrane potential oscillations. This mechanism might be employed in PDF-dependent synchronization. The analysis of peripheral pacemaker neurons focused on the characterization of the M. sexta olfactory receptor (OR) coreceptor (MsexORCO). Other insects' ORCO orthologues were shown to be required for membrane localization of tuning ORs. They form heteromeric (OR/ORCO) complexes, which function as ion channels mediating olfactory transduction in heterologous expression systems. It was hypothesized that MsexORCO functions as pacemaker channel in pheromone-sensitive ORNs in vivo, which generates subthreshold membrane potential oscillations, rather than being part of an ionotropic ion channel complex. MsexORCO was heterologously coexpressed with pheromone receptor candidates in human embryonic kidney (HEK 293) cells. Immunocytochemistry and Ca2+ imaging experiments revealed a very low expression rate of MsexORCO. Nevertheless, the experiments indicated that MsexORCO functions as spontaneously active, Ca2+-permeable ion channel, sensitive to the ORCO agonist VUAA1 and probably also to cyclic nucleotides. Additionally, the pheromone receptor candidate MsexOR-1 was suggested to be the bombykal receptor. The characterization of MsexORCO in primary M. sexta ORN cell cultures was not accomplished since these cells did not respond to ORCO agonists or antagonists.
URI: urn:nbn:de:hebis:34-2015101449134
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