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KOBRA - Dokumentenserver der Universität Kassel  → Fachbereiche  → FB 10 / Mathematik und Naturwissenschaften  → Institut für Biologie  → Fachgebiet Zoologie  → Dissertationen 

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http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:hebis:34-2016022949910

Titel: Analysen der beiden cis-regulierenden Sequenzelemente translational control element (TCE) und cytoplasmic polyadenylation element (CPE) in der Drosophila-Spermatogenese
Autor(en): Bublak, Stefanie
Schlagworte (SWD): DrosophilaSpermatogenese
Klassifikation (DDC): 570 - Biowissenschaften, Biologie (Life sciences)
Erscheinungsdatum: 29-Feb-2016
Zusammenfassung: Ein essentieller Bestandteil in dem Mechanismus der Translationskontrolle sind RNA-Pro­tein-Wechselwirkungen. Solche Interaktionen konnten in Translationssystemen an zwei unabhängigen cis-regulierenden Elementen durch in vitro-Bindungsanalysen mit individu­ellen rekombinanten Proteinen dokumentiert werden. Im Fall des translational control elements (TCE), welches ein konserviertes Sequenz-Ele­ment in der Mst(3)CGP-Genfamilie darstellt, wird eine negative Translationskontrolle durch die Bindung der Proteine CG3213, CG12470, CG1898, dFMR1, Exuperantia und Orb2 an diese Sequenz vermittelt (Stinski, 2011). Neben den in Bindungsstudien positiv getesteten Kandidaten dFMR1 und Orb2 (Stinski, 2011) wurde in der vorliegenden Dis­sertation CG3213 als weiterer direkter Bindungspartner an das TCE dokumentiert. Ein Abgleich der genomweiten Zusammenstellung von Proteininteraktionen in der Datenbank InterologFinder lieferte zwei weitere potentielle Kandidaten: CG34404 und CG3727. Al­lerdings schließen Northern-Analysen und das Proteinexpressionsmuster eine zentrale Rolle in der Drosophila-Spermatogenese für diese nahezu aus. In Kolokalisationsstudien einiger TCE-Komplex-Kandidaten mit CG3213 als Referenz konnten eindeutige Überein­stimmungen der Fluoreszenzmuster mit CG12470 in der postmeiotischen Phase be­schrieben werden, wohingegen mit Orb2 (postmeiotisch) und CG1898 (prämeiotisch) nur eine geringe Kolokalisation erkannt wurde. Punktstrukturen in den Verteilungsmustern sowohl von CG3213 als auch von CG12470 ließen sich nicht mit ER- und mitochondrien­spezifischen Markern korrelieren. Im Anschluss der Meiose konnte eine deutliche Intensitätserhöhung des CG3213-Proteins beobachtet werden, was eventuell durch eine veränderte Translationseffizienz zustande kommen könnte. Exuperantia (Exu) stellt einen bekannten Regulator für eine Reihe von translationskontrollierten mRNAs dar (Wang und Hazelrigg, 1994). Die Quantifizierungen der CG3213-mRNA in exu-mutantem Hintergrund bestätigen, dass auch die Transkript­menge der CG3213-mRNA durch Exu reguliert wird, was die obige Interpretation stützen würde. Für das zweite cis-regulierende Element, das cytoplasmic polyadenylation element (CPE), konnte eine direkte Bindung mit dem CPEB-Homolog in Drosophila (Orb2) gezeigt wer­den, welches auch eine Komponente des mst87F-RNP-Komplexes ist. Ein vermuteter Interaktionspartner dieses CPEBs ist Tob, weshalb die Verteilung beider Proteine in einem Kombinationsstamm verglichen wurde. In dem teilweise übereinstimmenden Fluoreszenz­muster ist Tob an den distalen Spermatidenenden auffallend konzentriert. Das gesamte Tob-Muster jedoch legt eine Verteilung in den Mitochondrien nahe, wie die MitoTracker®-Färbung belegt. Somit wurde erstmals ein Mitglied der Tob/BTG-Genfamilie in der Droso­phila-Spermatogenese mit Mitochondrien in Verbindung gebracht. Die Lokalisierung die­ser Proteine ist bislang unklar, jedoch konnte eine Kernlokalisation trotz der N-terminalen NLS-Sequenz mit Hilfe einer Kernfärbung ausgeschlossen werden.RNA-protein interactions are crucial for translational control. Such interactions are investi­gated for two different cis-regulating elements by in vitro binding analyses using individual recombinant proteins. For the translational control element (TCE), which is a conserved element within the Mst(3)CGP-gene family, translational control is permitted by binding of the proteins CG3213, CG12470, CG1898, dFMR1, Exuperantia and Orb2 to this sequence. In addition to the identified direct interaction partners dFMR1 and Orb2 (Stinski, 2011), a direct bin­ding at the TCE sequence has also been demonstrated for CG3213. An alignment with a wide assortment of protein interactions in the database InterologFinder resulted in two new possible candidates: CG34404 and CG3727. However, Northern analyses as well as the protein expression pattern of both candidates make them unlikely to have a central role in Drosophila spermatogenesis. The fluorescent patterns of both CG3213 and CG12470 fully coincide, whereas only a weak colocalization exists for Orb2 (postmeiotic) and CG1898 (premeiotic). Aggregate structures in the expression patterns from CG3213 and CG12470 appear to be associated with membranous structures, but ER and mito­chondrial markers do not correlate. After meiosis, a drastic increase in the level of CG3213 protein is observed, which could be explained by an upregulation of translational efficiency. Exuperantia (Exu) represents a well known regulator of many premeiotically transcribed RNAs that are translationally con­trolled (Wang und Hazelrigg, 1994). The data show that the transcript level of the CG3213-mRNA is also regulated by Exu, supporting the above interpretation. For the second cis-regulating element, the cytoplasmic polyadenylation element (CPE), a direct binding with Orb2, the CPEB-homolog in Drosophila – which is also involved in the mst87F-RNP complex – is demonstrated. In colocalization studies of the CPEB and its possible interaction partner Tob, a common fluorescent pattern at the distal end of the spermatid bundles was observed. Additionally Tob shows an interesting distribution, which can be shown by MitoTracker® staining to be of mitochondrial origin. These are the first hints that a member of the Tob/BTG-gene family is associated with mitochondrial struc­tures during the Drosophila spermatogenesis. In the literature it is under investigation whether Tob proteins are present and functional in the nuclei of invertebrates, which cannot be confirmed by nuclear staining in Drosophila spermatids.
URI: urn:nbn:de:hebis:34-2016022949910
Sammlung(en):Dissertationen

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