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Title: Role of Rab5 in synaptic vesicle recycling
Authors: Wucherpfennig, Tanja
???metadata.dc.subject.swd???: Cytologie
???metadata.dc.subject.ddc???: 570 - Biowissenschaften, Biologie (Life sciences)
Issue Date: 28-Nov-2002
Abstract: During synaptic transmission, NT-filled synaptic vesicles are released by Ca2+-triggered exocytosis at the active zone. Following exocytosis, SV membrane is immediately re-internalized and synaptic vesicles (SVs) are regenerated by a local recycling mechanism within the presynaptic terminal. It is debated whether an endosomal compartment is involved in this recycling process. In contrast, it is well known from cultured mammalian cells, that endocytic vesicles fuse to the early sorting endosome. The early endosome is a major sorting station of the cell where cargo is send into the degradative pathway to late endosome and lysosome or towards recycling. Each trafficking step is mediated by a certain protein of the Rab family. Rab proteins are small GTPases belonging to the Ras superfamily. They accumulate at their target compartments and have thereby been used as markers for the different endocytic organelles in cultured mammalian cells. Rab5 controls trafficking from the PM to the early endosome and has thereby been used as marker for this compartment. A second marker is based on the specific binding of the FYVE zinc finger protein domain to the lipid PI(3)P that is specifically generated at the early endosomal membrane. This study used the Drosophila NMJ as a model system to investigate the SV recycling process. In particular, three questions were addressed: First, is an endosomal compartment present at the synapse? Second, do SVs recycle through an endosome? Third, is Rab5 involved in SV recycling? We used GFP fusions of Rab5 and 2xFYVE to visualize endosomal compartments at the presynaptic terminal of Drosophila third instar larval NMJs. Furthermore, the endosomes are located within the pool of recycling SVs, labeled with the styryl-dye FM5-95. Using the temperature-sensitive mutation in Dynamin, shibirets, we showed that SV recycling involves trafficking through an intermediate endosomal compartment. In cultured mammalian cells, interfering with Rab5 function by expressing the dominant negative version, Rab5SN causes the fragmentation of the endosome and the accumulation of endocytic vesicles. In contrast, when Rab5 is overexpressed enlarged endosomal compartments were observed. In Drosophila, the endosomal compartment was disrupted when loss of function and dominant negative mutants of Rab5 were expressed. In addition, at the ultrastructural we observed an accumulation of endocytic vesicles in Rab5S43N expressing terminals and enlarged endosomes when Rab5 was overexpressed. Furthermore, interfering with Rab5 function using the dominant negative Rab5S43N caused a decrease in the SV recycling kinetics as shown by FM1-43 experiments. In contrast, overexpression of Rab5 or GFP-Rab5 caused an increase in the FM1-43 internalization rate. Finally, standard electrophysiological techniques were used to measure synaptic function. We found that the Rab5-mediated endosomal SV recycling pathway generates vesicles with a higher fusion efficacy during Ca2+-triggered release, compared to SVs recycled when Rab5 function was impaired. We therefore suggest a model in which the endosome serves as organelle to control the SV fusion efficacy and thereby the synaptic strength. Since changes in the synaptic strength are occuring during learning and memory processes, controlling endosomal SV recycling might be a new molecular mechanism involved in learning and memory.Synaptische Vesikel werden während synaptischer Transmission durch Ca2+-induzierte Exozytose an der aktiven Zone freigesetzt. Sofort nach der Exozytose wird die synaptische Vesikelmembran endozytiert. Ein sich daran anschliessender Recyclingmechanismus regeneriert die synaptischen Vesikel. Es ist derzeit unbekannt, ob endosomale Kompartimente als Zwischenstation im Vesikelrecycling bedeutsam sind. Im Gegensatz dazu ist aus Zellkulturexperimenten bekannt, dass dort endozytische Vesikel mit dem frühen Endosomen fusionieren. Das frühe Endosom gilt als Hauptsortierstelle der Zelle, wo internalisierte Moleküle in den Degradationsweg zu spätem Endosom und Lysosom geschickt, oder in die Recyclingroute geleitet werden. Jeder dieser Transportwege wird von einem spezifischen Protein der Rab Familie kontrolliert. Rab Proteine sind kleine GTPasen die der Überfamilie der Ras GTPasen angehören. Da sich Rab Proteine an ihren Zielorganellen ansammeln werden sie als Marker für verschiedene endosomale Kompartimente verwendet. Rab5 kontrolliert den Transportweg von der Plasmamembran zum frühen Endosom. In Zellkultur wird Rab5 als Marker für frühe Endosomen verwendet. Ein zweiter endosomaler Marker beruht auf der spezifischen Bindung der FYVE Zinkfinger Proteindomäne an das Lipid Phosphatidylinositol-3-phosphat (PI(3)P), das am frühen Endosomen entsteht. In dieser Arbeit diente die neuromuskuläre Synapse von Drosophila als Modellsystem, um den Mechansimus des Vesikelrecyclings zu untersuchen. Insbesondere wurden drei Fragestellungen bearbeitet. Erstens, gibt es in der Präsynapse endosomale Kompartimente? Zweitens, haben Endosomen eine Bedeutung beim Recycling synaptischer Vesikel? Drittens, spielt Rab5 eine Rolle im Vesikelrecycling? GFP-Fusionsproteine von Rab5 und 2xFYVE wurden verwendet, um endosomale Kompartimente in der Synapse darzustellen. Es wurde weiterhin gezeigt, dass sich die Endosomen innerhalb des Pools synaptischer Vesikel befinden. Mit Hilfe der temperaturempfindliche Mutation in Dynamin, shibirets, wurde gezeigt, dass endsomale Kompartimente als Zwischenstufen beim Recycling synaptischer Vesikel verwendet werden. Aus Zellkulturexperimenten ist bekannt, dass eine Störung der Rab5 Funktion durch Expression der dominant negativen Form von Rab5, Rab5SN, zur Fragmentation der Endosomen und zur Ansammlung endozytischer Vesikel führt. Die Überexpression von Rab5 hingegen hat eine Vergrösserung der Endosomen zur Folge. Auch in Drosophila ist Rab5 auch für die Intaktheit von Endosomen und für endosomales SV Recycling notwendig. Dies wurde mit Hilfe von Verlustmutationen, dominant negativen und Gewinnmutationen von Rab5 gezeigt. In den Verlustmutanten und dominant negativen Mutanten war das endosomale Kompartiment zerstört. Weiterhin wurde in Rab5SN exprimierenden Synapsen auf ultrastruktureller Ebene eine Ansammlung endozytischer Vesikel beobachtet. In Rab5 überexprimierenden Synapsen hingegen fanden wir vergrösserte endosomale Kompartimente. In FM1-43 Experimenten wurde gezeigt, dass die Inhibition von Rab5 eine Reduktion der Recyclinggeschwindigkeit synaptischer Vesikel zur Folge hat. Im Gegensatz dazu führte die Überexpression von Rab5 oder GFP-Rab5 zu einer erhöhten FM1-43 Internalisationsrate.
URI: urn:nbn:de:hebis:34-494
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